菌種是一個國家的重要自然資源， 菌種保藏工 作是一項重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作， 菌種保藏工作者的任務(wù)是把從自然界分離得到的野生型或經(jīng)人工 選育得到的用于科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)等方面的優(yōu)菌種 、 菌株，用各種適宜的方法妥善保存， 使之達(dá)到 不死、 不衰 不變異 、 不污染，在長時間內(nèi)保持原有的生產(chǎn)性狀和生命活力，以便于科學(xué)研究和生產(chǎn)使用。　自增壓液氮罐　

1　 微生物菌種保藏的基本原理　　
人們在長時間的工作實踐中， 根據(jù)微生物的不 無論何種保藏方法，主要是根據(jù)微生物生理 、 生化特同要求，在菌種保藏工作中不斷摸索出各種方法。　　

2      保藏菌種用培養(yǎng)基　　
為了有效地保藏微生物菌種， 首先需要有良好的培養(yǎng)基。因此， 研究選用適宜的培養(yǎng)基是微生物 菌種保藏最基本的工作。例如，ATCC (美國的一個 微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)) 在 1970 年以前采用的培養(yǎng)基 有 498 種，1974 年有 724 種，1978 年達(dá)到 1006 種，平 均每年增加 60 多種。　　

3　 微生物菌種的保藏方法　　
將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上， 待菌 充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好， 移至 4 ～ 6 ℃ 的冰箱中保藏。 保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌 、 放線 菌及有芽孢的細(xì)菌保存 2～4 個月，移種一次。酵母 菌兩個月，細(xì)菌最好每月移種一次。斜面菌種應(yīng)保 藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照， 防止因意外和污染造 成損失。 此法的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度影響其保藏質(zhì)量。 培養(yǎng)時間過短，保存時容易死亡， 培養(yǎng)時間長， 生產(chǎn) 性能衰退。一般以稍低于生長最適溫度培養(yǎng)至菌種 成熟進(jìn)行保藏，效果較好 [6 ]。 此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法， 優(yōu) 點是操作簡單，使用方便， 不需特殊設(shè)備， 能隨時檢 查所保藏的菌株是否死亡 、 變異與污染雜菌等。缺 點是容易變異，因為培養(yǎng)基的物理 、 化學(xué)特性不是嚴(yán) 格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響 微生物的性狀 ; 污染雜菌的機(jī)會亦較多。　　

液體石蠟保藏法

亦稱礦物油保藏法， 定期移植保藏法的輔助方 法。
(1) 液體石蠟的準(zhǔn)備 : 選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石 蠟，將液體石蠟分裝加塞， 用牛皮紙包好， 采用以下 兩種方式進(jìn)行滅菌 : ①
121 ℃濕熱滅菌 30 min， 置 40 ℃ 恒溫箱中蒸發(fā)水分， 經(jīng)無菌檢查后備用。 ② 160 ℃ 干熱滅菌 2 h，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用。
(2) 斜面培養(yǎng)物的制備 : 將需要保藏的菌種， 在 最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 使得到健壯的菌體或 孢子。
(3) 灌注石蠟 : 用滅菌吸管吸取滅菌的液體石 蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1 cm 為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。
(4) 保藏 : 將試管直立，置低溫 (4～6 ℃ 干燥處 ) 或室溫下保存 (有的微生物在室溫下比冰箱中保存保藏 2 年以上不死， 酵母菌可保藏 1 ～ 2 年， 一般無 芽孢細(xì)菌也可保藏 1 年左右， 甚至用一般方法很難 保藏的腦膜炎球菌， 在 37 ℃ 溫箱內(nèi)， 亦可保藏 3 個 月之久。此法的優(yōu)點是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且 不需經(jīng)常移種。缺點是保存時必須直立放置， 所占 位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培 養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時，培養(yǎng)物容易與 殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。

濾紙保藏法
(1) 將濾紙剪成 0. 5 cm × 2 cm 的小條， 裝入 1.0. 6 cm × cm 的安瓿管中，每管 1～2 張，塞以棉塞， 8 121 ℃ 滅菌 30 min。
(2) 需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。 (3) 滅菌脫脂牛乳 1 ～ 2 mL 滴加在滅菌培養(yǎng)皿 或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。
(4) 用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液 內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
(5) 將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的 干燥器中，用真空泵抽氣至干。
(6) 將棉花塞入管內(nèi)， 用火焰熔封管口， 保存于 低溫下。
(7) 需要使用菌種， 復(fù)活培養(yǎng)時， 可將安瓿管口 在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破 裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃， 待安瓿管開啟后， 取 出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。 細(xì)菌 、 酵母菌 、 絲狀真菌均可用此法保藏， 前兩 者可保藏 2 年左右， 有些絲狀真菌甚至可保藏 14 ～ 17 年之久。此法較液氮 、 冷凍干燥法簡便， 不需要 特殊設(shè)備。　　

沙土保藏法
(1) 取河沙加入 10 %稀鹽酸， 加熱煮沸 30 min，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。
(2) 倒去酸水，用自來水沖洗至中性。
(3) 烘干，用 40 目篩子過篩， 以去掉粗顆粒， 備 用
(4) 另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅的時間還要長 )。保藏時間 2 ～ 10 年。保藏期間應(yīng) 定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時補(bǔ)充無菌的液 體石蠟。
(5) 恢復(fù)培養(yǎng) : 恢復(fù)培養(yǎng)時， 挑取少量菌體轉(zhuǎn)接 在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一 次。 此法實用而效果好。霉菌 、 放線菌 、 芽孢細(xì)菌可土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。
(5) 烘干，碾碎，通過 100 目篩子過篩， 以去除粗 顆粒。
(6) 按一份黃土 、 三份沙的比例 (或根據(jù)需要而 用其他比例， 甚至可全部用沙或全部用土 ) 摻合均 勻，裝入 10 mm × mm 的小試管或安瓿管中，每管 100 裝 1 g 左右，塞上棉塞，121 ℃ 濕熱滅菌 30 min，烘干。
(7) 進(jìn)行無菌檢查，每 10 支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng) 48 h，若仍有雜菌， 則需全部重新滅菌， 再作無菌試驗， 直至證明無菌， 方可備用。
(8) 選擇培養(yǎng)成熟的 (一般指孢子層生長豐滿 的，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好 ) 優(yōu)良菌種， 以無菌水 洗下，制成孢子懸液。
(9) 每支沙土管中加入約 0. 5 mL (一般以剛剛 使沙土潤濕為宜) 孢子懸液，以接種針拌勻。
(10) 放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽 干時間越短越好，務(wù)使在 12 h 內(nèi)抽干。
(11) 每 10 支抽取一支， 用接種環(huán)取出少數(shù)沙 粒，接種于斜面培養(yǎng)基上， 進(jìn)行培養(yǎng)， 觀察生長情況 和有無雜菌生長， 如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本 不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣 檢查。
(12) 若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰 箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌 情況。
(13) 需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，取沙土少許移 入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。


此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌 、 放線 菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣， 效果亦好， 可保存 2 年左右，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。　　以上各法可根據(jù)實驗室具體條件與需要選用， 最好是每株菌種都采用兩種以上的保藏方法， 并根 據(jù)保藏菌種的保質(zhì)期，每隔一定時間，進(jìn)行入藏菌種 的復(fù)活檢驗和更新。自增壓液氮罐